人类白细胞抗原基因分型技术平台规范化建设及临床应用专家共识

中国输血协会人类组织抗原专业委员会 中华医学会血液学分会 国家血液系统疾病临床医学研究中心
Working Party on Histocompatibility, Chinese Society of Blood Transfusion The Hematology Branch of the Chinese Medical Association National Clinical Research Center for Hematologic Diseases
何军，苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所，苏州 215031，Email：junhe1964@163.com He Jun, Jiangsu Institute of Hematology, the First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215031, China, Email: junhe1964@163.com

人类主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）位于人类6号染色体短臂的21.31区域，DNA片段长度3 600 Kb，由一组紧密连锁的基因群组成，其编码的抗原分子在人类称为人类白细胞抗原（human leukocyte antigens，HLA），HLA具有结构复杂、多基因性、高度多态性、单体型遗传、连锁不平衡等特征［1］。HLA-A、B、C属于经典HLA-Ⅰ类基因座位，HLA-DR、DQ、DP属于经典HLA-Ⅱ类基因座位，HLA-E、F、G、H属于非经典HLA-Ⅰ类基因座位。最新国际免疫遗传学/人类白细胞抗原（IPD-IMGT/HLA）数据库（2023-04 3.52版本）公布HLA-Ⅰ类位点共有25 509个等位基因，HLA-Ⅱ类位点共有10 754个等位基因。基因测序分型（sequencing based typing，SBT）技术是HLA基因分型的金标准，具有特异性强及准确性高的特点；但其针对HLA-Ⅰ类基因座位的第2、3、4外显子以及HLA-Ⅱ类基因座位第2、3外显子的关键区域进行扩增和测序，存在测序区域覆盖不全、难以判断不能确定等位基因型分型结果等局限性。近年来，国内外已使用下一代测序（next generation sequencing，NGS）技术进行HLA基因分型，NGS技术是对HLA基因组全长序列进行测序，其测序的深度和广度都高于SBT法，具有通量大、速度快、可同时检测经典HLA-Ⅰ类和HLA-Ⅱ类基因、非经典HLA-Ⅰ类基因等优势，并且98%以上样本可直接获得唯一、最高等位基因分辨率的分型结果，不仅为患者赢得了最佳的临床治疗及移植时间，而且为HLA基因在异基因造血干细胞移植（allogenic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）、疾病相关性、药物和输血不良反应等临床研究中的应用提供科学依据。因此，HLA基因分型从最早血清学技术到NGS技术的革命性突破，对HLA配型实验室技术平台的规范化建设、质量管理控制、结果报告和解释、临床应用等方面，均带来新的问题及挑战。

由于HLA具有复杂的等位基因多态性、种族差异性，因此，其存在分型技术的选择、结果分析和判读、结果解释和临床咨询等相关问题，都可能会影响HLA基因分型检测结果的准确性及临床决策。为解决HLA基因分型技术中关键问题，在参考国内外相关指南、行业标准、规范和文献的基础上，中国输血协会人类组织抗原专业委员会、中华医学会血液学分会组织HLA、移植等相关领域的专家共同起草了本共识，系统梳理了HLA基因分型技术平台规范化建设及临床应用中的关键内容，对于WS/T 785-2021《人类白细胞抗原基因分型检测体系技术标准》中的内容不重复阐述［2］。

 第一部分 HLA基因分型技术平台规范化建设 一、建设HLA基因分型技术平台的基本要求 （一）申请开展临床检测的资质

推荐意见1：对于开展HLA基因分型等临床检测服务的实验室（简称：实验室），应依据并符合卫办医政［2010］194号文件《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》的要求申请备案，各省市可根据卫生行政部门对技术审核和登记备案的管理要求实施后开展临床检测工作。实验室可根据自身发展需求申请中国合格评定国家认可委员会（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）组织的ISO15189医学实验室认可［3］，及美国组织相容性和免疫遗传学协会（American Society for Histocompatibility and Immunogenetics，ASHI）实验室国际认证等［4］。

实验室开展HLA基因分型等临床检测项目，应将接收的样本视为具有潜在感染性样本进行处理。为了防止检测前，如接收和处理样本过程中产生的气溶胶；检测过程中如扩增子污染；检测后医疗废弃物处理等造成生物安全隐患，特别是实验室如接收外部样本，尤其是境外样本，考虑可能存在潜在感染风险更大，建议进行生物安全实验室（bio-safety laboratory，BSL）2级备案。如果HLA基因分型由检验科、病理科等科室开展，可与所在科室一同备案。

 （二）场地和设施的要求

推荐意见2：实验室根据开展的临床检测项目、检测物、覆盖专业及生物安全要求设计实验场地，必须按功能设计生活区和工作区，工作区可分为普通和核心区域。单向设计人流、物流（试剂或耗材）、样本流、污物流（废弃物、废水）、气流（清风、送风、排风）。合理布局逃生通道、喷淋和洗眼装置、防火设备、卫生设置等，以及配备温湿度设备、监控设备（冷链、摄像）、服务器和数据储存设备、生物安全柜等。

1. 设施设备：实验室可设置独立的样本接收室，配备电脑、通讯设备和紫外消毒设施，以满足样本接收时各类送检信息核对、登记和录入、与临床沟通完善送检信息、患者及供者样本整理、接收与拒收以及暂存样本的需求。

2. 生物安全防护：实验人员在样本接收和处理时，应按照BSL-2要求做好个人防护，对样本外包装进行消毒及统一处理。标本开盖易产生气溶胶、溢洒等，该类操作均在生物安全柜内按标准操作规程（standard operation procedure，SOP）进行。实验结束后，应按照医疗废弃物处理原则对实验废弃物、废液进行处理，并对生物安全柜等设备进行清理、消毒和维护。

3. 防污染措施：实验室应按照WS/T 785-2021行业标准的规定，建立防污染检测体系和擦拭检测措施。

 （三）人员资质的要求

推荐意见3：实验室应根据从事技术平台不同，配备有相应学历、专业和资质证书的专业技术人员。对于关键岗位技术人员，如实验室质量和技术负责人、授权签字人、给出临床建议、咨询意见和解释的人员等，在申请相关实验室认证时，均有一定的要求。

1. 结果审核人员：大学本科以上，在实验室工作经历至少5年以上，熟练掌握各项技术，具有分析和解决常见问题的能力。

2. 结果报告发布人员：实验室应对报告发布人员的资质予以规定，如CNAS认可实验室对于授权签字人的资质要求：本科、5年以上专业经历、中级以上职称；ASHI认证实验室要求报告发布岗位人员应经过相关认证机构授权，通常由实验室负责人、主管担任。

3. 结果解读、临床咨询、临床建议人员：经实验室主任授权，由具有专业背景、技术能力、工作经历、研究能力和沟通能力等综合能力体现的专业人员从事该工作。CNAS、ASHI建议临床咨询岗位人员应具有医学检验、生物学等相关专业博士学历学位，或临床医学本科及以上学历学位，通常由实验室主任、负责人或其他由实验室主任授权人员担任。

 （四）培训与考核

推荐意见4：实验室应针对不同岗位、年资、职称等，制定分阶段的岗位培训计划及相应的考核内容和方法。培训内容应包括但不限于实验室相关制度、生物安全、专业技术、质量管理、仪器设备使用和维护等。培训方式可为实验室集中面授、专业组内培训、独立实验操作等。员工经培训并通过考核后授权上岗，从事与培训内容对应的岗位工作。

实验室对人员的培训、考核及周期应按照WS/T 785-2021行业标准、CNAS、ASHI有关规定执行。可对新员工、老员工、轮岗员工设置不同的培训内容和考核时间，低年资人员应侧重考核实验操作能力，高年资人员应侧重考核解决问题能力。建议新入职人员应首先接受实验室相关制度和生物安全培训，再接受专业技术和质量管理相关培训，培训时长一般要求3个月以上。

 （五）仪器、试剂的选择

推荐意见5：实验室必须根据临床需求选择经确认符合临床预期用途的检验程序，应选择国家药品监督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）批准注册的试剂和仪器开展临床检测项目［5］，并进行性能验证。性能验证应满足但不限于试剂生产商说明书中声明的内容，结果应符合试剂说明书中性能指标的参数。实验室除按照试剂、仪器说明书的要求外，还应参照医学检验相关国标、行标等要求，建立仪器、试剂和耗材的采购、评估和储存，仪器使用、维护、维修和校准等必须的SOP文件。

1. 基于Luminex技术平台应用序列特异性寡核苷酸探针（sequence specific oligonucleotide probe，SSOP）方法进行基因分型：应配备流式荧光检测仪及配套分析软件，试剂包括扩增、杂交试剂，仪器数据采集所需的鞘液、校准微珠等。

2. 基于SBT技术进行基因分型：应配备基因测序仪，试剂主要包括扩增及测序试剂，基因扩增产物纯化试剂、产物测序前溶解核酸的试剂，如高度去离子甲酰胺及基因分析仪所用的分离胶，如POP-7聚合物等。还需要配备与试剂配套的HLA基因分型分析软件。

3. 基于NGS技术进行基因分型：应配备高通量测序仪及配套分析软件，可依据测序读长、测序通量，综合考虑测序准确率、运行时间、测序成本、测序质量，结合生物信息支持的可用性、平台的灵活性、可扩展性等，选择边合成边测序、半导体测序、联合探针锚定聚合测序等测序平台。文库构建试剂建议选择扩增子文库构建法或探针杂交捕获法的配套试剂；选择无核酸去离子水、分子生物级无水乙醇；实验的各种量程枪尖、PCR反应管等耗材推荐选用低吸附度耗材。

4. NGS技术上机测序试剂：根据测序仪型号和检测通量选择高通量测序平台的上机测序试剂。不同型号测序仪配套上机测序试剂不同，同型号测序仪也配备有不同通量的上机测序试剂。

5. 生物信息平台设备基本要求：NGS平台数据量较大，需配备服务器或工作站电脑满足分析软件要求。电脑配置应满足生物信息分析的要求，数据储存建议配备服务器或其他存储设备，并进行异地备份。

6. 其他仪器设备：配备包括核酸抽提仪、浓度测定仪、基因扩增仪、电泳系统及成像系统、磁力架（可放置96孔板、2 ml 离心管）、恒温孵育仪、核酸片段分析仪、Qubit荧光定量仪、超净台、生物安全柜、纯水仪、离心机、移液器、冰箱及混匀震荡仪等设备。

 （六）服务协议的评估和签署

推荐意见6：实验室接受委托检验服务，应与委托检验的机构签订服务协议。服务协议中的内容应包括但不限于协议双方的责任和权限，实验室资质，HLA基因分型技术平台和分辨水平，质量控制管理能力，项目价格，报告发放时间，样本采集、运送、保存的要求，临床咨询及解答临床疑难病例的服务，报告发放对象保密性规定，合作时间等内容。经双方协商后签署服务协议，并应定期评审服务协议。

1. 检测要求：实验室依据协议中送检样本检测目的不同，如移植前患者和供者HLA基因分型、二次移植供者选择、HLA杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）检测、HLA与疾病相关性等，实验室应与委托方协商后明确采用的方法学，以满足检测目的和对送检样本的要求，并建议在服务协议中予以体现。

2. 保密性规定：实验室如与中国造血干细胞捐献者资料库管理中心（简称中华骨髓库）有签约协议，必须遵守中华骨髓库所有管理要求，如信息保密性规定、网络安全等。中华骨髓库供者及患者的分型报告，实验室必须在中华骨髓库指定信息系统内上传，不可向第三方泄露供受者信息及实验室数据。实验室必须严格保密患者和供者、临床医生、其他服务对象的信息以及实验室数据。移植医院患者及亲缘供者的分型报告仅可授权发送至申请医生、患者本人，或者服务协议明确的委托机构授权代表人。报告授权发放对象建议在服务协议中予以体现。

 二、开展HLA临床检测项目的性能验证实施方案

推荐意见7：实验室在选择NMPA批准注册商品化体外诊断（in-vitro diagnostic，IVD）试剂和仪器开展HLA基因分型临床检测项目时，应验证检测系统性能参数的结果是否符合临床预期用途，建立检测前、中、后全流程的关键环节质量控制指标、SOP文件和记录表单等，证实该临床检测项目的测量系统、实验方法、试剂和耗材、仪器设备等均达到性能指标要求，满足预期用途后才能在临床开展。而对于选择合成引物、探针，购买扩增缓冲液、酶等试剂自建实验方法；或使用NMPA商品化试剂但改变了其预期用途、试剂组分或实验操作流程，均需按照实验室自建检测方法（laboratory developed test，LDT）或仅供科研使用的试剂（research use only，RUO）进行项目性能确认管理。

（一）基本要求

实施项目性能验证和性能确认方法的基本要求见表1。

10.3760/cma.j.cn112137-20230317-00422.T001

实施HLA基因分型临床检测项目性能验证和性能确认方法的基本要求

项目 性能验证 性能确认
目的 满足厂商宣称性能和预期用途 满足检测预期用途的特定要求
适用范围 商品化IVD，配套检测系统、固定组合的检测系统的标准方法 LDT等非标准方法，实验室设计或制定的方法、超出预期用途使用的标准方法、修改后的实验方法
样本类型 检测采用厂商宣称的样本类型 使用各种样本类型检测均需确认
样本数量 不低于20例，可根据预期用途增加 至少50例，根据预期用途一般不低于100例
样本来源 临床样本（已知结果为主）、第三方质控品、室间质评样本 临床已知结果样本（至少有3家不同机构提供）、室间质评或比对样本
性能指标 符合率、重复性、检测限 符合率、重复性、检测限、特异性、灵敏度
判断标准 试剂或检测系统说明书提供的性能参数 实验室根据预期用途自行建立（可参考相关标准或文献）
执行者 开展临床检测实验室 开展临床检测实验室、方法研发机构

注：HLA为人类白细胞抗原；IVD为体外诊断产品；LDT为实验室自建检测方法

 （二）性能验证

推荐意见8：HLA基因分型检测项目的性能验证应包括但不限于以下内容：样本类型、核酸提取及质量评估、符合率（金标准方法学、基因型）、检出限、重复性。必要时对基因扩增效率、杂交或纯化得率、测序峰、分析软件等内容进行验证。性能验证方案、检测过程、原始结果、评估报告、记录表单等均应在实验室长期保存。根据HLA等位基因复杂性，建议性能验证样本数量不低于100例，样本数量可根据预期用途增加。

推荐意见9：实验室应选择与试剂配套的软件进行数据分析，用于软件安装的设备参数及运行环境应符合说明书的要求。应对所安装的软件及涉及的IPD-IMGT/HLA数据库、HLA常见及有记录（common and well-documented，CWD）的等位基因数据库等进行性能验证，用于验证的样本应涵盖CWD和Rare基因、纯合子和杂合子、存在碱基改变等不同等位基因类型。验证内容应包括但不限于分型结果的正确性、软件的功能、分析参数及软件初步分析结果与人工判断结果的一致性和差异性。根据性能验证结果制定实验室分析软件系统的SOP文件。

1. 样本选择：实验室应选择已知结果的临床样本、国家标准品和参考品、室间质评样本等。样本类型如外周血、口腔黏膜细胞（拭子或唾液）、脐带血、组织及细胞等，需要针对不同样本类型进行性能验证。此外，样本类型的选择应包括基因分型结果为纯合子或杂合子的样本，各位点应尽量涵盖中华骨髓库发布的《中国常见及确认的HLA等位基因表（CWD）》（目前为2.4版本）中80%以上常见等位基因，并建议涵盖10%有记录的等位基因和1%~2%罕见等位基因。

2. 核酸提取及质量评估：实验室应针对不同样本类型制定不同技术平台的核酸提取方法及质量评估标准。按照试剂说明书、WS/T 785-2021行业标准、CNAS-GL039［6］等规定对DNA的完整性、浓度、纯度进行评估。NGS技术在定量核酸浓度时推荐使用荧光染料法，不推荐使用定量总核酸的分光光度计（Nanodrop法）或其他紫外吸收法。

核酸提取方式可采用磁珠吸附法或离心柱提取法，对于外周血细胞数偏高或偏低的患者样本推荐选择离心柱提取法，提高核酸纯度和回收率。唾液样本需选用专用抽提试剂进行核酸抽提，保证唾液样本内DNA完整性。抽提后的DNA样本重悬于pH 8.0~9.0的缓冲溶液（如Tris-HCl）中以便长期保存。

采用NGS方法提取核酸要求DNA结构完整，无抑制酶活性的有机溶剂或过高浓度的金属离子，无生物大分子如蛋白质、多糖和脂质分子，并排除其他核酸分子（如RNA）污染。建议使用高通量测序试剂推荐并已验证的方法和提取设备，或实验室已验证的其他商品化试剂。

3. 符合率：用已知HLA等位基因分型的DNA样本进行与金标准方法学的基因型符合性检测，结果判定标准应为与原基因型100%符合。采用去离子水进行核酸抽提的产物作为阴性样本，阴性样本应无分型结果或无探针捕获信号、测序信号。

4. 检出限：根据试剂说明书声明的检出限验证DNA的有效浓度。如SBT方法提示DNA浓度介于10~100 ng/μl，SSOP方法提示DNA浓度介于20~250 ng/μl。建议选择该浓度范围内低值、中间值、高值梯度各3~5个DNA样本进行重复检测3次，结果判断标准为处于检出限浓度内的样本100%检测到基因型，且与已知基因型100%符合。

5. 重复性：重复性包括批内、批间、人员间重复性结果的符合率，应根据说明书的声明方式去进行验证。如选择3~5个DNA标准品或已知结果的样本，在不同批次由同一技术人员重复检测3~5次，并在同一批次实验内进行复孔检测3~5次，从而验证批间、批内的重复性，要求与已知基因型100%符合。

6. 分析灵敏度：分析灵敏度是指用该分子检测技术能够检测到生物样本中待测靶核酸分子的最低含量，定性实验中分析灵敏性常用最低检测限来表达。

7. 分析特异性：分析特异性在HLA基因分型技术中特指标本中的干扰物对检测正确性的影响。内源性干扰物主要为药物等，外源性干扰物常见于采集和处理标本的过程，如抗凝剂等。实验室可根据临床需求、厂家声明和样本特点进行干扰物验证。

8. 分析软件系统：（1）数据分析软件的功能：包括软件对仪器产出原始数据的导入和识别、对NGS方法碱基序列的识别和拼接、对SBT方法碱基序列的识别、对SSOP方法探针荧光信号的识别、与参考数据库的比对及判断等位基因的碱基差异和初步分型结果等功能。（2）SBT方法关键参数的分析：包括对测序峰碱基信号强度、碱基识别质量、序列开头引物结合部位碱基剪切位置的合理性、与参考序列的吻合性及正反向序列的一致性、双峰判断比值及背景值等的分析。（3）SSOP方法关键参数的分析：包括对微珠最低读数、阴性质控微珠最高值、阳性质控微珠最低值、探针阴/阳性反应判断正确性等的分析。（4）NGS关键参数的分析：包括对测序深度、均一性、覆盖度、等位基因平衡等的分析，详见下文。

 三、应用NGS技术开展HLA基因分型性能确认方法

实验室应用NGS技术开展HLA基因分型，应选择有NMPA批准注册证的高通量测序仪及测序试剂。根据文库构建方法不同，可选择扩增子法或杂交捕获法的文库构建试剂及与试剂配套的分析软件。故在临床开展HLA基因分型检测前需对整个项目进行性能确认，包括湿实验和干实验两个部分［7, 8］。

（一）湿实验的性能确认

推荐意见10：湿实验性能确认应包括但不限于以下内容：仪器设备、试剂和耗材、样本处理、核酸提取和质量评估、文库制备、上机测序步骤等。

1. 测序仪的性能确认：由仪器工程师在安装后按照说明书所要求的仪器性能指标，对光学系统、液路系统、进样系统等逐项验证，并进行标准品运行测试。仪器性能指标应达到仪器生产商声称的指标且满足临床预期用途，方视为仪器性能合格。

2. 文库制备：文库制备是将基因组DNA片段化，并在片段末端连接寡核苷酸接头的过程。目前应用NGS技术进行HLA基因分型文库构建方法常为扩增子法［9］、杂交探针捕获法［10］。不同建库方法其文库制备原理不同，但文库制备过程中片段选择、文库质量测定、上机测序文库浓度调整均为关键实验步骤。（1）扩增子法：采用多重PCR扩增富集目标区域，扩增子经DNA片段化、末端修复、接头连接、磁珠纯化、富集扩增等步骤完成文库构建。扩增子法文库构建可检测单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）、小片段的插入或缺失，但覆盖范围受引物限制、PCR多重扩增均一性等制约。（2）杂交探针捕获法：采用磁珠的液相捕获技术，利用生物素标记探针在杂交过程中捕获目标区域。片段化反应采用连接在磁珠上的转座酶，同步实现基因组DNA 片段化和接头（包括标签序列和测序引物序列）连接，通过片段选择、探针杂交捕获、富集等步骤完成文库构建。杂交探针捕获法因无PCR扩增步骤，避免了PCR反应引入的偏向性，重复基因组区域覆盖度较均匀。杂交探针捕获法文库构建可检测SNP、大片段的插入或缺失等，但受探针捕获效率、序列中GC分布的制约。（3）文库制备流程：①核酸浓度：不同文库制备方法要求核酸浓度不同，一般不低于10 ng/μl，或根据文库制备试剂说明书要求调整初始核酸浓度。②基因组片段化：常用片段化方式有内切酶法和转座酶切法。扩增子法采用核酸内切酶法片段化，经末端修复，通过一步或两步磁珠纯化法实现目的基因与标签序列及测序引物的连接。杂交探针捕获采用转座酶方法可同步实现片段化和连接过程。③标签序列：称为barcode或index，一般6~12 bp，均属人工合成的已知序列。两种建库方法均使用双标签标记，将多份样本混合后加入一张芯片，测序后需通过识别序列上的标签区分不同样本。④片段选择：两种建库方法均通过调整磁珠的比例，分选连接标签和测序引物目的基因片段，并去除标签二聚体及大小不符合建库要求的片段。磁珠的体积是影响文库片段长度大小的关键。⑤文库质量：采用Qubit荧光染料法检测文库浓度，或采用实时荧光定量PCR仪（qPCR）检测文库中有效连接接头的文库浓度；必要时通过核酸片段分析仪（如Aglient Tape Station系统）验证文库片段大小，即插入片段和接头序列的总长度，应主峰明显、无杂峰、无接头、无引物二聚体，合格文库插入片段长度可根据文库制备试剂说明书确定。

3. 上机测序：定量后文库需调整摩尔浓度，以提高测序质量。实验室根据测序仪及型号，对上机测序文库终摩尔浓度进行验证。按文库制备试剂说明书编写上机样本信息，确定样本唯一标签序列。边合成边测序法推荐在检测体系中加入序列已知的平衡文库（Phix Control v3），比例1%~5%，用于判断测序反应中单碱基连接反应是否提前或滞后、监测测序平台整体性能、测序实验运行质量，起到均衡四种碱基荧光信号的作用。上机测序试剂中的试剂卡盒应避免反复冻融，使用前上下反复混匀后确认底部无气泡，并确保流动槽或芯片位置放置正确。控制仪器室湿度在30%~75%，避免流动槽玻璃表面凝结水汽，影响成像清晰度。

 （二）干实验的性能确认

推荐意见11：干实验的性能确认应包括但不限于以下内容：测序仪产生数据的质量指标：如簇密度、簇通过率、碱基识别质量百分比（quality scores，Q值）、数据产出量；分析软件的参数：如碱基识别、标签识别、序列拆分、参考序列比对、碱基插入、缺失、错配的识别；HLA分型数据分析的参数：如测序深度、测序均一性、测序覆盖率、等位基因平衡等。

1. 测序仪产生数据的质量指标：边合成边测序法、联合探针锚定聚合测序法平台产生的测序数据主要包含序列信息和相应的碱基质量值，包括簇密度、簇通过率、Q值、数据产出量等。半导体测序法平台产生数据的质量指标，包括测序碱基信号值，如Ion球形颗粒（ion sphere particles，ISP）密度、平均测序短序列（reads）长度、ISP连接DNA链的比例等。Q值是测序过程中碱基识别的错误概率，每个测序平台都会给出Q值，以Q30表述，每批实验均需监测Q值。数据产出量用单次测序可获得序列信息的基因片段数量或可测定的碱基数量表示。

2. 分析软件的参数：高通量测序仪常用仪器本地数据格式转换工具（如：bcl2fastq）进行碱基识别，对下机原始数据，依据序列上的不同标签进行序列拆分，获得不同样本的fastq、bam.等格式测序数据，完成初级分析。导入与试剂配套数据分析软件后，通过去除质量低于Q30的碱基、引物二聚体序列、重复序列，去除接头序列（标签序列、引物序列、测序引物结合序列）、与现用版本IPD-IMGT/HLA数据库的参比序列，实现测序序列与参比数据库的比对，进行比对后数据处理，获得HLA等位基因型的分析结果，完成数据二级分析。

使用与试剂配套数据分析软件进行数据二级分析，设置参数可包括但不限于以下内容：生成分型数据最低有效的reads数目、最大reads数目、可分析reads最短长度、可允许插入最大碱基数、缺失最大碱基数、错配最大碱基数、判断等位基因分型结果时任意碱基位置的最低有效reads数目、碱基可识别的最低比例、杂合子最低等位基因平衡度等。在上述测序仪产生数据的质量指标达标、分析软件参数均合格的情况下，才能进行HLA分型的数据分析。

3. HLA分型数据分析的参数：（1）测序深度：指特定区域碱基识别的有效核酸测序片段，用reads数目来表示，reads数目越多，深度越高，检出碱基的可信度越高。（2）测序均一性：在基因组某一特定区域内测序的一致性。测序深度和均一性是测序数据质量的主要因素，评估均一性可以计算测序深度的最低比例。（3）测序覆盖率：是达到给定深度的测序碱基占整个基因组或目标区域的百分比，与文库构建试剂相关。高通量测序可覆盖HLA基因的外显子，或包含内含子及非翻译区（untranslated regions，UTRs）。（4）等位基因平衡：等位基因多态性位置两个碱基的比例，区分纯合位点或杂合位点。两个碱基比例相近时判为等位基因平衡，当低于可接受的阈值时判为等位基因不平衡。

 （三）应用NGS技术开展HLA基因分型检测项目性能确认的判断指标

推荐意见12：HLA基因分型检测项目性能确认的判断指标，可参照厂商或研发者在试剂盒或检测系统说明书中的声明，应包括但不限于以下内容：基因型符合率、精密度、最低检测浓度、数据量、Q30>80%的百分率、测序深度、均一性、测序覆盖率、序列拼接长度或平均reads长度、高背景碱基识别和判断、等位基因序列拼接、等位基因不平衡等。

1. 基因型符合率：采用已知分型结果的DNA（如临床、室间质评或能力验证项目）样本和去离子水的阴性样本，与金标准方法学检测结果比较，分型结果与已知结果100%符合。

2. 精密度：包括重复性和重现性，结果100%一致。当使用多台基因测序仪或扩增仪器时，须评估仪器间重复性。

3. 最低检测浓度（limit of detection，LoD）：指至少95%的样本能够准确检出基因分型结果的最低检测浓度。杂交捕获法文库构建一般要求样本的初始核酸浓度LoD为10 ng/μl，样本体积10 μl；建库产物总浓度不低于3 ng/μl，片段不小于675 bp；以采用边合成边测序法MiseqDx仪器为例，推荐上机文库摩尔浓度首先调整至4 nmol/L，再稀释到合适的上机模板浓度。建议实验室基于自身的检测系统，评估并设定LoD值。

4. 数据量：测序产出数据量通常在2~6 GB，以常用边合成边测序法的双端150 bp、V2芯片为例，HLA产生数据量一般要求应达到4~5 GB。

5. Q30>80%的百分率：采用Q30判断碱基质量，杂交捕获方法要求95%的样本Q30值>88%。

6. 测序深度：杂交捕获方法要求95%的样本测序深度不低于100×~150×，最低测序深度30×；扩增子方法建议最低测序深度不低于200×。

7. 均一性：要求reads片段在检测区域均匀分布。

8. 测序覆盖率：要求各基因位点测序序列100%覆盖目标区域，尤其关键外显子区域必须完全覆盖并达到所要求的测序深度。杂交捕获和扩增子方法均可对HLA-Ⅰ类A、B、C位点，HLA-Ⅱ类DRB1、DQB1、DPB1、DRB3/4/5、DQA1、DPA1位点进行全基因组或全外显子测序。对于关键外显子，两种方法均需查看HLA-Ⅰ类基因Exon2、3、4区域，HLA-Ⅱ类基因Exon2、3区域。

9. 序列拼接长度或平均reads长度：杂交捕获方法要求reads序列拼接长度为700 bp左右；扩增子方法要求平均reads长度>100 bp。

10. 高背景碱基的识别和判断：测序错误、序列拼接错误导致测序序列中某个位置碱基的数目或比例不符合软件分析阈值，出现的位置和碱基类型固定，常与等位基因相关，造成结果分析错误。需记录影响结果分析的高背景碱基位置、类型及比例，建立碱基有效识别及无效识别的判断标准，在后续结果分析中加以分析。特别应注意对于实施移植后送检样本，在分析中需要区别移植后患者样本中因错配移植产生的等位基因嵌合，不可判为高背景。

11. 等位基因序列拼接：等位基因序列包括完全拼接和无法完全拼接，无法完全拼接是高通量测序结果存在不能确定等位基因型的主要原因。如等位基因为杂合子，参考区分序列的两个保守多态性碱基间距离，超过试剂最长序列拼接长度，如DPB1*05∶01+13∶01/DPB1*135∶01+519∶01；或数据库中等位基因序列不完整时，如DPB1*02∶01+05∶01/DPB1*414∶01+744∶01，均提示不能确定的等位基因型结果。

12. 等位基因不平衡：杂交捕获方法中当两个等位基因碱基序列的reads比例<38%、扩增子方法<1∶3或更低时，提示等位基因不平衡，低比例等位基因易造成漏检。存在高GC碱基的核苷酸区域，等位基因序列扩增或捕获效率较低，是造成序列中reads比例不平衡的主要因素，实验室应建立可接受的等位基因不平衡最低比例。

 四、性能验证或性能确认报告

推荐意见13：HLA基因分型性能验证或性能确认报告至少应包括但不限于以下内容：目的；原理和方法学简介；试剂和耗材；仪器设备维护及校准；实验场地和生物安全；样本来源及性质；性能验证或确认指标（符合率、检出限、重复性、特异性、生信分析、软件分析、数据库等）；SOP文件和简易操作卡；结果分析和原始记录；验证结论；结果报告、报告单发放方式；结果解释或解读（特殊类型、基因变异、家系分析等）；技术的局限性、不足及需要说明的问题；参考文献；附录（原始结果、试剂和仪器重要说明书）等。

 五、SOP的建立

推荐意见14：实验室各技术平台通过实验方法的建立和优化，建立及完善检测系统，明确常规检测过程中每个环节的质控指标及判断标准，形成项目的SOP文件体系及其实验流程记录表，并在规定时间内完成评估及更新。SOP文件可包括但不限于以下内容：目的，原理和方法，仪器和试剂，样品类型、样本采集、运送处理和保存，标准实验操作步骤及关键实验步骤，数据分析软件的使用，质量控制规则，结果分析、结果报告和解释、进一步检测的建议，常见问题及解决办法，分析软件的升级及IPD-IMGT/HLA数据库更新，试剂的接收、出入库及质量控制，仪器的维护校准及维修，参考文献、附表及附录等。对于特殊样本类型及让步检验时，需要在结果分析和报告时进行相应的解释和备注。

 第二部分 HLA基因分型检测全过程的质量控制 一、HLA基因分型检测前的质量控制

推荐意见15：实验室应建立标本采集、暂存、运输、接收、验收的质量管理程序文件，提供标本采集和项目手册，对关键环节设立质量目标、质量指标；建立不同样本接收和拒收标准及标本前处理的SOP文件。样本的识别性、唯一性、溯源性、安全性等内容的风险评估是检验前质量管理的重点，及应监控纠正措施和持续改进的效果。检测申请单的设置可由临床或协议单位共同参与评估。

1. 申请单：拟进行allo-HSCT或器官移植而寻求HLA基因分型的患者，申请检测除需提供基本信息外，还需明确患者与供者关系，至少两种标识（姓名、出生年月或身份证号），申请的分型位点和分辨率水平，以及与样本质量或结果判断相关信息，如首次/二次移植、白细胞计数、化疗及用药情况、患者的致敏史、接受的抗体清除治疗方案及治疗时间等，因此需要由临床或协议单位共同参与申请单内容制定及评估。

2. 样本接收和拒收：WS/T 785-2021行业标准已规定实验室对样本信息不足、样本处理及运输不当、样本量不能满足检测、抗凝方式不当作为拒收样本处理。对于恶性血液病患者，因疾病、药物治疗等原因，可存在外周血白细胞数量异常、口腔黏膜细胞（拭子或唾液）样本采集过程是否正确等情况，都将影响样本质量并对检测结果造成影响。实验室需针对接受样本的来源、类型等，建立不同样本接收、拒收程序文件，及前处理的SOP文件。

对于血液病患者需明确样本送检时间为allo-HSCT移植前或移植后，以及具体的送样时间；初诊时高白细胞计数的患者需达到缓解或部分缓解后再送样检测；化疗患者需待化疗结束后、下一化疗周期开始前、且外周血白细胞计数正常时再行采样；特殊药物如羟基脲、靶向药物治疗期不可送检外周血样本。髓系或淋系白血病移植后复发、需二次移植的患者，建议同时送检外周血、口腔拭子或唾液。患者化疗或因病情原因，白细胞计数无法达到采样要求，临床加急情况下可送检口腔黏膜细胞样本。

3. 质量指标：实验室应设置相应的质量指标，如样本丢失率、周转时间（turn-around time，TAT）等，并定期对质量指标和目标值进行评估，评价纠正措施的有效性，以达到持续改进的目的。

4. 风险评估：样本丢失、相互混淆是样本接收和处理过程的风险重点。实验室为防止样本混淆，样本唯一性标识应具有可溯源性，检验前的唯一标识可为检验申请单编号、中华骨髓库无关供者骨髓编号或患者编号、供/患者姓名等；检验中及检验后的唯一标识可为实验室检测编号。为防止样本丢失，实验室应可监控样本接收和登记过程，全流程应有核对和交接记录。

 二、HLA基因分型检测过程中的质量控制 （一）试剂和关键耗材的质量控制

推荐意见16：实验室应建立试剂、关键耗材的质量管理程序文件，包括试剂订购、接收、保存、质控、使用期（包括分装后使用期）、有效期等过程。通过质控可确保检测结果的正确性，对于不同批号试剂宜选择5个以上DNA 质控品或已知结果的样本进行质量验证；相同批号不同批次试剂宜选取1~3个DNA 质控品或已知结果的样本进行质量验证；与试剂盒同批次的配套试剂，宜与试剂盒同时进行质量验证，不同批次的配套试剂、其他通用试剂及自配试剂应单独进行质量验证。应建立试剂分装、储存时间等有效性验证，确保试剂在有效期内使用，并保存质控记录。试剂和关键耗材的质量验证结果应与已知基因型100%符合，所有质控记录和原始数据均应存档保留。

1. 配套试剂：SSOP方法配套试剂主要为热稳定DNA聚合酶（TaqDNA polymerase），SBT方法配套试剂主要为基因扩增产物的消化试剂、纯化试剂、高度去离子甲酰胺、POP-7聚合物等，NGS方法配套试剂主要为建库、纯化、标签、测序试剂等。

2. 通用试剂：实验过程中使用的DNA浓度、片段检测试剂，无核酸去离子水，无水乙醇，电泳缓冲液、琼脂糖、染料、DNA标志物等试剂。

3. 自配试剂：NGS文库变性使用NaOH储存液（pH>12.5）配置新鲜的工作液，NaOH储存液分装后-20 ℃保存，单支开封使用后丢弃。SBT测序纯化中80%无水乙醇应保证使用前配制。

4. 关键耗材的质量验证：对枪尖、离心管、PCR反应板、PCR反应管等影响实验质量的关键耗材，应进行外观检查及质量验证。外观检查可包括表面裂痕、内壁液体残留、气密性、枪尖与移液器的匹配度等；质量验证可采用已知结果的样本通过完整的实验流程，比较新旧耗材实验结果是否一致，一致即可判断此批耗材通过质量验证。

5. 其他：试剂标记、供货商评价、试剂管理等要求按照WS/T 785-2021行业标准执行。

 （二）仪器维护和校准的质量控制

推荐意见17：实验室应建立仪器设备的选择、购买、验收、标识、使用、维护、维修、校准和报废的质量管理程序性文件，确保仪器设备的正常运行、操作人员的安全及检测结果的准确可靠。对于实验室的大型精密仪器，如基因扩增仪、流式荧光检测仪、基因测序仪、高通量测序仪等，技术人员不仅应按照仪器说明书要求进行日维护、月维护、年维护、校准等工作，及由具有资质的校准机构出具校准报告外，还应对校准内容进行实验验证，并确认仪器性能符合检测的要求。仪器搬迁后应进行仪器校准及性能验证。

1. 基因扩增仪：每月进行孔内擦拭实验；每半年/每年由具有校准资质的工程师进行1次维护校准。校准参数包括孔内温度精度性测试、孔间温度均一性测试、升降温和循环数测试等。在校准维护后由实验室工作人员进行验证，基因扩增仪的年维护和校准应特别注意孔间温度均一性。通常选取已知结果的样本，采用常用试剂对HLA基因位点覆盖所有温度模块进行检测，校准前后结果一致即可通过。

2. 流式荧光检测仪：每次仪器使用前后进行开机及关机维护，并定期冲洗加样针以防加样针堵塞。在开机维护完成后，按照仪器说明书要求进行微珠校准及验证，校准微珠对红绿激光进行校准，验证微珠对分子通道进行验证。每年由厂家工程师进行1次年维护，包括激光校准及液路系统的验证及更换。仪器年维护校准通过后由实验室工作人员进行维护后的验证。通常采用已知HLA基因分型结果的样本进行基因分型检测，校准前后结果一致即可通过。

3. 基因测序仪：每次仪器使用前后进行仪器的日常维护，定期更换检测系统的液体，并做好仪器管道、卡槽的清洁。每年由厂家工程师进行年维护，内容主要包括仪器进样系统检测、仪器光路维护、激光校准、空间定位、四色荧光染料标准品光谱校正、结合使用时间确定是否更换毛细管、计算机的参数检测等。仪器年度维护后由实验室工作人员进行校准后的验证，可采用已读板重新上机读取数据，校准前后结果一致即可通过。

4. 高通量测序仪：在仪器运行前后，使用实验级别水（Milli~Q或分子生物级别）配制洗液，进行清洗维护，以防止液路和吸管中的试剂残余，避免与前一次运行的交叉污染。每年维护由厂家工程师现场完成，包括更换系统配件，如空气滤网；对系统部件检查和维护，如试剂吸液针吸管、试剂装载槽、触摸屏、加热块进行系统测试，必要时升级测序系统软件。仪器年度维护后由实验室工作人员进行校准后的验证，可采用已知HLA基因分型结果的样本进行基因分型检测，校准前后结果一致即可通过。

 （三）室内质量控制

推荐意见18：实验室应建立室内质控物的类型、检测频次、质控物的位置、质控记录、在控和失控规则的质量管理程序性文件。应确保实验的稳定性和检验结果的可靠性，每批次实验至少设置阳性和阴性质控物。阳性质控物宜采用临床样本、标准品、细胞株等。应规定在一个时间段内选择的阳性质控物至少覆盖HLA-CWD等位基因型。阴性质控物为去离子水。阳性、阴性质控物应与临床样本同步参与核酸提取、扩增检测、结果分析、记录的全流程。

1. 质控物及质控频次：每批次的检测过程中必须设置阴性、阳性质控物。阳性质控物应包括CWD和罕见的等位基因，每次使用至少1种以上基因型；室内质控品与临床样本在同样测定条件下检测。质控物位置不能固定，应随机放置且插入在标本排序中。

2. 质控结果分析：阴性质控样本无分型结果，阳性质控结果与原基因型一致，判断为质控在控。当检测人员发现阴性质控出现扩增条带并能得到分型结果，阳性质控与已知结果不一致或无法得出结果，判断为失控，应及时分析失控的原因并采取纠正措施。阴性质控物提示可疑阳性时，应首先考虑实验室内部的扩增子、气溶胶的污染，采用擦拭实验法排查原因、确定污染源，需针对性采取清除污染措施，擦拭实验为阴性时，实验方可启用。阳性质控提示阴性结果时，应首先考虑实验操作失误、试剂失效、质控品失效、仪器性能等原因，需重复检测阳性质控物与预期结果一致，当结果不一致时将所有临床样本再次检测。

3. 质控记录：每批次实验完成室内质控分析和记录，每月或每季度、每年度对各检测项目进行室内质控汇总分析和报告，内容包括室内质控样本的数量、比例、等位基因覆盖度、正确率等，如有失控时进行原因的分析和报告。

 （四）数据分析的质量控制

推荐意见19：仪器产出的原始数据导入试剂配套分析软件被有效识别，分析参数至少达到试剂厂家说明书的最低要求时，判断为质量合格，并进一步分析。在分析过程中重点关注等位基因平衡度、双峰和高背景信号、测序深度和均一性、等位基因拼接的完整性、探针荧光信号值等关键指标。应保留结果分析过程中的所有记录，对于数据质量不合格的样本，分析原因并采取纠正措施。

1. SSOP方法的数据分析：（1）合格数据的判断：微珠最低读数应达到50，探针荧光信号阴性质控微珠平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）一般为0~100，阳性质控MFI值一般可达到1 000~4 000。（2）探针荧光信号阴、阳性判断：阳性百分比值高于cut-off值为阳性反应，低于cut-off值为阴性反应。试剂批号更换后cut-off值可能会改变。在数据分析时，需逐个分析每个探针，重点分析处于cut-off值附近的探针，必要时可结合本批次实验中多个样本的探针信号值进行判断。

2. SBT方法的数据分析：（1）合格数据的判断：关键外显子应覆盖完整、峰图清晰、等位基因平衡，碱基信号强度至少应达到500以上，通常要求达到1 000~2 000以上。（2）测序双峰和背景峰的判断：两个碱基信号中低峰与高峰的比值为判断双峰或背景峰的cut-off值，软件默认的cut-off值一般为25%。人工分析时应重点关注处于软件cut-off值附近的碱基信号，杂乱的碱基信号一般为背景峰，必要时重新检测；对于清晰的碱基信号，当等位基因序列中存在多个碱基峰比例不平衡时，通常应判为双峰。如果发现在某位点特定的碱基位置、特定的等位基因或等位基因组合中经常出现不平衡双峰、高背景，一般和引物设计有关，应重点记录和备注，以防止发生数据分析错误。

3. NGS方法的数据分析：（1）合格数据的判断：等位基因序列覆盖全基因组或全外显子、测序深度至少100×、reads片段在检测区域均匀分布。（2）分析记录内容：包括高背景碱基、碱基错配类型及位置、不能确定的等位基因型组合、等位基因拼接不完整、覆盖度低的基因、等位基因不平衡、基因的缺失等。其中高背景碱基识别和判断、等位基因序列完全拼接及无法拼接、等位基因不平衡等是数据分析需关注的重点。对于行单体型相合或HLA等位基因错配移植的移植后患者，移植后外周血或唾液样本中可能嵌合供者来源的基因型，在测序序列中同时存在供受者来源的碱基类型，比例高低不同，即使比例较低也不能按高背景碱基排除，需结合患者移植前及移植供者的分型结果一同分析。

4. 数据分析中的其他注意点：在SSOP、SBT、NGS方法的数据分析时，当存在无法确认的分型结果、纯合子、碱基改变等情况时，应采用其他试剂、其他方法进行复核。如NGS方法存在等位基因碱基的改变，可用一代测序方法区分和复核；存在等位基因同源序列无法明确结果，应采用不同原理的试剂或分析软件验证［11］；参考家系单体型等进行判断，以防止等位基因漏检及上报错误的分型结果。

 （五）不能确定等位基因分型结果的分析

实验室应按照WHO的HLA命名原则报告HLA基因分型结果，当报告等位基因分辨水平和高分辨水平分型结果时，应报告等位基因*后至少4位分型结果，唯一等位基因型可以直接上报。当判断为不能确定的等位基因型结果时，实验室应采用以下多种方法予以区分。

1. 判断不能确定的等位基因型结果的基本原则：实验室可参照中华骨髓库发布的《中国常见及确认的HLA等位基因表（CWD）》2.4版本、ASHI CWD数据库［12, 13］，遵循《中国造血干细胞捐献者资料库HLA高分辨分型确认实验室管理办法（2023版）》《中国造血干细胞捐献者资料库HLA基因分型数据入库标准（2021版）》，及美国骨髓库无关供者和患者确认分型标准［14］、脐带血供者和患者确认分型标准［15］，进行不能确定等位基因分型结果的判断。

HLA分型结果为唯一等位基因型、可接受G组结果时，实验室可直接上报；为CWD1、CWD2/rare1、rare2等位基因组合时，在排除rare1、rare2后，实验室可按CWD1、CWD2上报。

HLA不能确定等位基因分型结果包括CWD1、CWD2/CWD3、CWD4等位基因组合；CWD1、CWD2/CWD3、rare等位基因组合；存在已报道的A*68∶11N、B*15∶01∶01∶02N、C*04∶09N等Null基因的G组分型结果时，实验室应予以区分后上报。

2. 区分不能确定等位基因分型结果的方法：HLA分型结果为两条染色单体上等位基因双链杂合序列相同的组合，如C*03∶03∶01、14∶03∶01/C*03∶04∶01、14∶10，可采用组特异性测序引物（group specific sequence primer，GSSP）、组特异性引物（group specific primer，GSP）等实验学方法予以区分；如DRB1*12∶01∶01G包含的DRB1*12∶01∶01/DRB1*12∶10结果，可采用增加关键外显子以外区域测序的方法予以区分。另外在区分不能确定的等位基因型结果时，家系单体型分析可作为实验学方法以外的补充。

 （六）数据库的更新和验证

推荐意见20：实验室IPD-HLA/IMGT数据库应至少每年更新1次至最新版本；中华骨髓库或ASHI发布新版本CWD等位基因数据库时应及时更新。数据库更新后，应选择涵盖CWD和罕见基因、纯合子和杂合子、碱基改变等不同等位基因型的样本，采用新老版本数据库对相同数据进行分析和比对，完成数据库更新的验证报告，其内容可包括但不限于样本选择情况、分型结果的正确性、变化内容或改进情况、存在问题及应对措施等。新版本数据库经验证通过及实验室授权人员批准发布后，方可在临床检测中使用。

 （七）能力验证或室间质评

实验室应根据开展临床检测项目制定能力验证计划，包括参加机构、频次、样本数量、判断标准等，均符合实验室开展项目的临床预期用途。采用比对方案时，应选择获得CNAS认可和相关国际认证实验室或使用相同检测方法的同级别或高级别实验室，确定比对方式的可接受性、规定比对样本数量、频次、判断标准等，并形成比对报告。

实验室应通过定期参加室间质量评价（external quality assessment，EQA）或能力验证（proficiency testing，PT）来评估实验室检测能力，参加外部质控项目可包括但不限于：国家卫生健康委临床检验中心HLA基因分型/B27基因检测项目、中华骨髓库质量控制实验室HLA基因分型质控项目、美国ASHI的HLA基因分型/B27检测项目、美国加利福尼亚大学洛杉矶分校（UCLA）免疫遗传中心HLA基因分型检测项目。

实验室接收EQA/PT成绩合格或比对结果通过的反馈后，技术平台所有人员应知晓反馈结果并签字。当EQA/PT成绩不合格或比对结果不符合时，不仅应调查和分析不符合原因，采取纠正措施进行更正，而且应采取预防措施防止相同问题在不同技术平台上再次发生，并按照WS/T 785-2021行业标准对行为规范及记录归档的要求执行。

 三、HLA基因分型检测后的质量控制 （一）结果复核的质量控制

推荐意见21：实验室对结果复核应包括但不限于以下内容：对申请单上基本信息、检测项目、样本编号，以及影响样本质量和检测结果判断的诊疗信息的复核；对实验操作关键步骤、数据分析关键指标的复核；对分型结果进行等位基因CWD判断、不能确定等位基因分型结果的判断、家系单体型分析、等位基因连锁分析，及确认最终上报的基因型；对报告单上的分型结果，结果解释、备注及建议等的复核。所有复核过程均应保留记录。

1. 申请单的复核：实验室应核对报告单与检测申请单上的基本信息、检验项目、样本编号的一致性及完整性。关注可能影响样本质量和检测结果判断的诊疗信息，如在患者处于化疗期、靶向药物治疗期，或肿瘤高负荷、重型再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）等疾病状态时采集的样本，可能造成样本无法得到分型结果或结果不明确，实验室应与临床沟通，待治疗结束或缓解后重新送检外周血样本，或送检口腔黏膜细胞样本进行检测。患者行HLA单体型相合移植或无关错配移植后的样本，需结合患者移植前和供者结果进行分析。

2. 实验操作中关键步骤的复核：实验室应重点关注实验操作过程中对于关键步骤的双人复核，如加样、转板等过程；以及室内质控放置位置及结果的正确性，以监控整批实验结果的可靠性。

3. 数据分析和分型结果的复核：在数据分析时，应对等位基因不平衡、双峰和高背景信号、碱基改变位置、探针荧光信号值、等位基因拼接完整性、区分常见等位基因的碱基或探针等关键指标进行复核。应对等位基因CWD判断、不能确定等位基因分型结果、等位基因连锁判断，经人工复核及确认最终上报的基因型。家系单体型分析时若存在疑问，应核对检验前样本编号、DNA抽提环节及实验操作环节是否存在样本混淆，排除样本混淆后，与临床沟通并进一步处理。

 （二）检验后样本的保存和使用

实验室检验后样本的保存与处理方式应按照CNAS认可等要求执行，通过评估后规定检验后样本储存有效性的条件和期限。WS/T 785-2021行业标准要求基因组DNA在-20 ℃保存超过1年后，再使用前应重新验证样本质量。

 四、结果报告的质量控制及临床解读 （一）结果报告的质量控制

推荐意见22：实验室应在HLA基因分型报告单中包括但不限于以下内容：供受者关系、样本接收和检测时间、试剂和仪器、基因型相合度分析、单体型分析、临床意义及进一步检测的建议、让步检验说明等，并且应规范、正确使用带有认可或认证资质标识的报告单。

1. 报告单的发放：报告的内容，格式，发放形式（纸质、电子、口头报告），修改，保存等均应符合WS/T 785-2021行业标准的规定。

2. 患者基本信息：包括姓名、性别、出生日期、诊断等，宜使用出生日期代替年龄，对于同名同姓的样本可通过出生日期、身份证号码等唯一性标识识别。

3. 家系单体型分析：在明确亲属关系的基础上进行家系单体型分析，若家系单体型与申请单上提供的供患关系不符，应及时与临床联系，必要时重新送样复检后再发放报告单，或根据临床要求的方式发放报告单，或不进行家系单体型分析等。

4. 不同样本类型结果的分析：对于单体型相合移植或无关错配移植后患者，应分析供、患者来源基因型占比，及不同来源样本（外周血、口腔黏膜细胞等）的HLA分型结果。

 （二）HLA基因分型报告的临床解读

推荐意见23：实验室应根据临床需要对HLA基因分型报告单进行相关解读，包括但不限于以下内容：对基因型相合度、家系单体型、G组基因、CWD和罕见基因、碱基改变或新基因等内容进行解释，移植后供受者来源基因型占比的分析，不同来源样本的结果分析，二次复检结果分析，进一步检测建议等。对于HLA与疾病相关性的报告单，应对基因型、血清型进行解读，及供受者匹配度分析。

1. 基因型相合度及家系单体型分析：应对报告单上的供受者进行基因型相合度分析；在明确亲属关系的基础上进行家系单体型分析。对于基因型相合而单体型不合的情况应醒目提示临床；对于基因型相合的直系或旁系亲属，若不能明确单体型是否相合，应给出增加检测位点或送检相关亲属样本的进一步检测建议。

2. G组结果解释：当分型结果中存在G组结果时，对G组包含的等位基因型或组合进行解释。

3. 罕见和有记录的基因、不存在等位基因的解释：当分型结果中存在罕见或有记录的基因时，对参考数据库中报道的及实验室检测到的例数进行说明，为预测患者检索到无关供者概率提供参考依据。常见的HLA-DR51、DR52、DR53单型中，除DRB1外，还分别含有DRB5、DRB3、DRB4等DR座位；HLA-DR1单型含有DR1、DR10等特异性；HLA-DR8单型特异性为DR8。当出现DRB1*01、DRB1*08、DRB1*10基因时，提示不存在DRB3/4/5基因［16］。

4. 碱基改变或新基因解释：碱基改变是指碱基序列与IPD-IMGT/HLA数据库比对后，提示与WHO已命名基因型的参考序列存在碱基差异。实验室应对碱基改变位置和类型、是否发生在抗原识别区域（antigen recognition domain，ARD）进行确认［17］，及对关键外显子最接近基因型给予说明，如HLA-DQB1*06等位基因在关键外显子Exon2 275 bp碱基由A变为C，为ARD碱基改变，按DQB1*06∶XX上报，其核苷酸序列与DQB1*06∶01最接近。患者的碱基改变可能为遗传来源或与疾病相关，可结合父、母基因分型结果进行分析，也可在移植前送检口腔黏膜细胞或缓解状态的外周血样本进行复核，排除与疾病相关后方可上报为新基因。

5. 连锁关系的解释：HLA-H缺失（deletion，DEL）基因与A*24或A*23存在连锁关系［18］；MICA缺失（DEL）基因与B*48、MICB*009∶01N存在连锁关系［19］。当分型结果出现以上情况时，应予以解释。

6. 不同来源样本结果分析：当患者处于肿瘤高负荷、移植植入失败或移植后复发等状态时，外周血与口腔黏膜细胞分型结果可能不一致，应对不一致分型结果进行说明。

7. 移植后结果分析：患者行HLA单体型相合移植或无关错配移植后的样本，分型结果可能转变成供者基因型，或供受者嵌合基因型。对于供受者嵌合基因型应分析供受者来源基因型占比，为分析是否存在HLA区域的杂合性缺失提供依据。

8. 二次复核结果分析：根据ASHI要求，移植前应对供受者重新采集样本，送检HLA基因分型进行二次复核，并对复核结果的一致性进行说明。

9. 进一步检测的建议：如增加检测HLA位点；重新送检缓解后外周血样本或唾液等样本进行复检；送检潜在供者相关亲属样本，送检其他检测项目的建议等。

10. 让步检测的说明：对于危急、加急、治疗期间等患者采集的样本不符合检测要求时，经与临床联系并经同意后，作为让步检测处理，并在报告单中进行相关说明。

 五、报告发布的质量控制

推荐意见24：实验室报告发布环节应根据人员岗位设置授予不同权限，如查看、录入、审核发布、修改或更正信息或结果等。报告单经过授权签字人审核后方可发放，授权签字人应符合实验室获得的CNAS认可、相关国际认证机构资质及实验室主任的批准授权。实验室应规定纸质或电子报告单发放的TAT，并在规定的TAT内将报告单送达申请者，应定期验证检测报告从实验室到患者或申请者终端结果传输的正确性。

1. 报告单的正确性：应将纸质、电子报告单发放TAT、信息系统传输正确率等纳入实验室质量目标进行监控。电子报告单的发放若存在多种终端，应对各种终端上结果传输的正确性进行验证。

2. 报告单的发布：纸质报告单送达指定人员后，交接环节应双方签字确认、记录时间。通过信息终端发放的报告单，应确保患者能通过条码识别等方式查阅和打印。通过授权网站发放的报告单，如中华骨髓库供受者报告，应使用专用电脑、工作人员用户名和密码登录后，完成结果录入、保存，由另一人审核、提交发布。通过电子邮件等方式发放的报告单应发送给授权账号，发放人员签字、记录时间。

 六、信息系统的管理

1. 人员授权和职责：实验室应制定信息系统管理流程，并规定相关环节涉及人员的职责和权限，包括信息系统维护和修改的申请、批准、实施、验证，及审核发布的人员职责和权限；登录信息系统查看、录入、修改或更正，及审核发布患者信息、结果的职责和权限；对信息系统中数据进行整理、备份和验证的职责和权限。

2. 数据的保存、备份及验证：实验室应遵循WS/T 785-2021行业标准，以及CNAS认可和相关国际认证机构的要求，对数据、报告、记录进行保存、备份和验证。应定期对原始数据、电子报告和记录进行本地不同设备间备份和异地备份，建议实验室永久保存原始数据、电子报告和相关记录。应制定对备份数据的正确性和完整性进行验证的方法、时间、内容等管理文件，并定期核查数据保存和备份的相关记录。

3. 数据的安全性：实验室应根据检验工作流程需要配备充足的电脑硬件及软件，并合理规划内网和外网的分配和布置，内、外网物理分隔，产出人类基因数据的大型仪器设备单机运行，控制移动存储设备的使用，以防止网络病毒风险。通过建立信息保密制度、信息系统登录和使用的人员授权制度、门禁制度等，防止信息的泄露和数据篡改。应针对风险环节制定应急预案，确保信息系统故障时能及时修复系统、恢复数据，或在系统外临时发放报告单，并及时通知临床。

 第三部分 HLA基因分型的临床应用 一、HLA基因分型在allo-HSCT潜在供者选择中的临床应用

HLA作为识别“自我”和“非我”的关键分子，在移植供者选择中发挥重要的作用。本共识重点阐述HLA基因分型在allo-HSCT中选择亲缘供者、旁系供者、非血缘无关供者、脐血供者中的应用，HLA等位基因可允许和不可允许错配供者选择，HLA-DP位点在供者选择中的作用，以及HLA位点基因丢失（HLA-Loss）、抗供者特异性抗体（donor-specific antibody，DSA）、HLA与疾病相关性和药物超敏反应的临床应用等方面。各移植中心的临床医生可根据患者与潜在供者的HLA基因分型相合程度、等位基因错配类型、单体型是否相同、供者的可用性进行亲缘供者或非血缘供者的选择。当临床无法判断而需要咨询HLA专家时，实验室应针对具有临床指导意义的结果进行解释和说明，必要时可结合相关资料进行HLA等位基因可允许或不可允许错配分析，为临床选择移植潜在供者提供建议。

（一）HLA基因分型在亲缘潜在供者中的选择建议

1.选择亲缘潜在供者（如父母、子女、兄弟姐妹）：推荐临床送检包括患者、父母在内的完整家系成员样本，采用NGS方法进行包括HLA-A、B、C、DRB1、DQB1、DPB1、DPA1、DQA1、DRB3/4/5（HLA-9位点）等位基因分型，由实验室专业人员进行HLA单体型分析，判断患者与亲缘供者HLA单体型相同、1条HLA单体型相同，HLA单体型不相同。对于存在单体型无法明确，如可能存在基因重组等情况，推荐检测主要组织相容性复合体上更多的非经典HLA位点、MIC基因（MICA和MICB），以便进一步明确HLA单体型，为判断其是否为合适的潜在移植供者提供更多依据。

当有多个1条单体型相合亲缘潜在供者可选择时，在考虑HLA等位基因错配类型、HLA-DSA等因素的基础上，北京大学人民医院研究结果显示：优先选择年轻的男性供者；年轻供者（≤30岁）有更低的非复发死亡（non-relapse mortality，NRM）发生率和更高的总生存率（overall survival，OS）；男性供者较女性供者有更低的移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）和NRM发生率，更高的OS和无白血病生存率（leukemia free survival，LFS）［20］。

2. 选择旁系潜在供者（如堂、表、侄、甥等）：推荐临床送检与患者有直系血缘关系的成员样本，采用NGS方法同步进行HLA基因分型检测，按遗传规律进行HLA单体型分析，以排除基因型相合而单体型不合的情况。浙江大学附属第一医院联合国内移植中心及欧洲骨髓移植（European Society for Blood and Marrow Transplantation，EBMT）协作组发表的研究结果显示：处于完全缓解状态的成年急性白血病患者，接受一代以外旁系供者和直系供者首次单体型相合移植的两个队列，在植入成功率、2年复发率、NRM发生率、急慢性GVHD发生率、2年OS、LFS、无移植物抗宿主病无复发生存（GVHD relapse free survival，GRFS）等方面均无显著差异。表明一代以外旁系供者与直系供者在单体型相合移植中疗效相仿，可作为直系供者的等效替代［21, 22］。

3. 选择非同胞HLA相合的亲缘供者（nonsibling HLA-matched related donor，NSMRD）经验分享：患者与父母或子女可能存在HLA-A、B、C、DRB1、DQB1（HLA-10/10）等位基因型相合的情况，其原因为他们之间共有中国人群常见单体型，特别是高频率、最常见单体型［23］。如选择NSMRD进行移植，需要增加HLA-DP位点及非经典HLA位点检测，不仅能明确1条相同的单体型，还能分析其他位点等位基因错配类型。苏州大学附属第一医院研究结果表明：接受NSMRD与同时期接受常规单体型相合HSCT的血液系统恶性肿瘤患者相比，有较高的复发率和较低的急性GVHD发生率［24］。

4. 患者的HLA分型结果提示某位点存在碱基改变时的供者选择：建议父母双方进行HLA基因分型及遗传学方面的基因检测，如HLA某位点存在的碱基改变来源于父母任一方，并在排除与遗传性疾病等相关后，可考虑选择为潜在供者。

 （二）HLA基因分型在无关潜在供者检索和选择中的建议

1. 供者检索策略：美国骨髓库（National Marrow Donor Program，NMDP）供者检索策略，推荐基于供受者HLA-A、B、C、DRB1、DPB1位点分型结果检索供者，考虑其他位点（如DQB1、DRB345）有助于优化检索策略［25］。在中华骨髓库检索无关潜在供者时，推荐患者首先采用NGS方法进行HLA-9位点的HLA等位基因分型，优先选择HLA-A、B、C、DRB1、DQB1位点或更多位点相合的供者进行高分辨确认分型。其次选择HLA-A、B、DRB1位点高分辨相合，其他位点可允许错配的供者进行高分辨确认分型。当患者疾病危急或无优先供者可选择时，建议对存在HLA-A、B、DRB1某位点等位基因或抗原错配的供者进行高分辨确认分型。

2. 供者选择建议：根据NMDP推荐无关供者选择建议，供受者HLA-A、B、C、DRB1错配位点个数增加与移植后OS降低、移植相关死亡（transplant related mortality，TRM）和GVHD发生率升高相关，故不推荐选择≤HLA-6/8相合的无关供者进行移植。在HLA-7/8相合情况下，低表达位点（DRB3/4/5、DQB1、DPB1）存在3个及以上的错配时，移植后OS降低、TRM升高［25］。选择中华骨髓库无关供者时，推荐优先选择HLA相合程度更高的供者；其次选择HLA-A、B、C、DRB1、DQB1相合，DPB1可允许错配的供者。对于存在HLA位点错配的供者，需要进行供受者HLA可允许或不可允许错配分析，选择等位基因为可允许错配或抗原相合的供者［26, 27］；对于多个供者存在相同HLA等位基因或抗原错配时，可考虑供者的年龄、性别、血型及可动员性等因素。当患者疾病危急时，尤其是患者为罕见等位基因、罕见单体型时，移植中心可根据临床情况，选择HLA错配供者进行移植，从而缩短等待移植时间。

3. 非亲缘脐血潜在供者的选择建议：脐带血有核细胞总数和CD34+细胞数、供受者HLA基因相合程度是影响脐带血移植后造血重建延缓和TRM的主要因素。推荐单份脐带血有核细胞数>2×107/kg、CD34+细胞数>1×105/kg［28］。研究显示：在单份脐血移植中，当供受者HLA-A、B、C、DRB1、DQB1位点≥7/10相合时，脐血CD34+细胞数即使低于0.85×105/kg也未显著影响移植后生存［29］；HLA≤6/10相合是脐血移植后持续孤立性血小板减少症（prolonged isolated thrombocytopenia，PIT）发生的独立危险因素［30］。除此以外，受者体内DSA抗体及供受者自然杀伤（natural killer，NK）细胞表面免疫球蛋白样受体（killer-cell immunoglobulin-like receptors，KIRs）也是必要的考虑因素［31, 32］，供者KIR-B组单体型及供受者HLA-C位点错配均有利于减低脐血移植后复发相关死亡的发生［29］。

在双份脐血移植中，首选两份脐血HLA位点全相合；其次如果双份脐血中存在错配，尽量选择在某一个相同位点上等位基因、抗原错配，或同处于交叉反应组的错配，并优先选择可允许错配，避免双份脐血中多位点交叉错配。当有两份以上脐带血可供选择时，还应考虑供受者ABO血型、双份脐血细胞数量，及回输脐血的前后顺序。研究显示：与细胞数足量的单份脐带血移植相比，使用双份脐血移植的患者移植后血小板植入情况较差，TRM风险升高，OS和LFS降低。但对于微小残留病灶（minimal residual disease，MRD）检测阳性并且在预处理方案中使用了抗胸腺细胞球蛋白（anti-thymocyte globulin，ATG）的患者，使用双份脐血移植的复发率低于使用单份脐血，3年OS高于使用单份脐血的移植［33］。

在单体型联合脐带血移植供者选择中，苏州大学附属第一医院研究结果显示：在单体型联合第三方脐血移植的供者选择中，HLA相合度及等位基因错配对预后均有意义。根据HLA-A、B、C、DRB1、DQB1位点高分辨分型，供受者HLA≥6/10相合，尤其是A位点等位基因相合，有利于提高移植后OS，降低TRM；供受者与脐血存在至少1条HLA单体型相合，有利于患者移植后造血重建［34］。

 （三）HLA等位基因可允许错配和不可允许错配分析

HLA可允许错配是供者T细胞发生适度的识别异基因产物的免疫反应，从而持续发挥移植物抗白血病（graft versus leukemia，GVL）效应；不可允许错配是指供者T细胞识别错配抗原后发生强烈的同种异体免疫反应，引起严重的细胞因子风暴，或者细胞毒性T细胞直接攻击靶器官，发生严重的急性移植物抗宿主病（acute graft versus host disease，aGVHD），导致靶器官受损。因HLA基因多态性分布受种族、区域分布的影响，故建议临床优先考虑中华骨髓库已公开发表的数据，并结合供者年龄、性别、血型等因素，以及其他文献资料综合考虑。实验室应根据现有文献报道和错配查询工具，结合本移植中心积累的临床数据分析，给予临床供者选择建议，以便临床结合患者疾病特征和病程分期，制定移植供者选择方案。目前已报道的可允许和不可允许错配HLA等位基因类型详见表2。

10.3760/cma.j.cn112137-20230317-00422.T002

目前已报道的可允许和不可允许错配的HLA等位基因类型

错配类型 对生存影响 文献 样本量（例） 疾病类型 移植时间 研究人群
C*03∶03-C*03∶04 对OS、LFS、TRM、Ⅲ~ⅣaGVHD无显著影响 Blood［35］ 7 349 ALL、AML、MDS、CML 1998—2009年 美国骨髓库（高加索人）
B*15∶01-B*15∶05C*04∶01-C*03∶04DRB1*12∶01-DRB1*12∶02DQB1*03∶02-DQB1*03∶03A*02∶06-A*02∶01aA*02∶03-A*02∶01 aA*11∶02-A*11∶01 aC*01∶03-C*01∶02 aDQB1*06∶01-DQB1*06∶02 a 对OS、Ⅱ~ⅣaGVHD无显著影响 中华血液学杂志［27］ 835 ALL、AML、MDS、CML、NHL、AA、地中海贫血 2005—2010年 中华骨髓库多中心研究
B*39∶01-B*39∶05C*15∶02-C*14∶02C*08∶01-C*03∶04C*07∶02-C*15∶02A*02∶01-A*02∶06 aA*02∶07-A*02∶06 aC*01∶02-C*01∶03 aDQB1*06∶02-DQB1*06∶01 a OS、Ⅱ~ⅣaGVHD的危险因素 中华血液学杂志［27］ 835 ALL、AML、MDS、CML、NHL、AA、地中海贫血 2005—2010年 中华骨髓库多中心研究
A*02∶06-A*02∶01 aA*02∶06-A*02∶07 aA*26∶02-A*26∶01 aA*26∶03-A*26∶01 aB*15∶01-B*15∶07 aC*04∶01-C*03∶03 aC*03∶03-C*15∶02 aC*03∶04-C*08∶01 aC*08∶01-C*03∶03 aC*14∶02-C*03∶04 aC*15∶02-C*03∶04 aC*15∶02-C*14∶02 aDRB1*04∶05-DRB1*04∶03 a 对重度aGVHD高风险 Blood［36］ 5 210 ALL、AML、MDS、CML、AA等 1993—2006年 日本骨髓库
受者携带C*14∶02的错配供者或受者携带B*51∶01的错配 对重度aGVHD、TRM高风险 Haematologica［37］ 6 967 ALL、AML、MDS、CML、AA等 1993—2010年 日本骨髓库

注：HLA为人类白细胞抗原；OS为总生存；LFS为无白血病生存；TRM为移植相关死亡；aGVHD为急性移植物抗宿主病；ALL为急性淋巴细胞白血病；AML为急性髓系白血病；MDS为骨髓增生异常综合征；CML为慢性髓系白血病；AA为再生障碍性贫血；NHL为非霍奇金淋巴瘤；a标记的错配类型指供者-受者的错配，如A*02∶06-A*02∶01a，指供者为A*02∶06，受者为A*02∶01；其余未标记的为不区分供受者错配方向的错配类型

 （四）HLA-DP位点在allo-HSCT供者选择中的作用

1. 中国人群HLA等位基因多态性和单体型的数据库：苏州大学附属第一医院基于NGS技术对4 845例中国汉族人群DPB1、DPA1、DQA1、DRB3/4/5位点的多态性进行了分析，与美国ASHI及欧洲EFI的数据库进行比较，20%~50%的CWD等位基因存在差异性，尤其是DPB1和DPA1位点，如DPA1*02∶02为中国人群最常见的等位基因，而在ASHI CWD数据库中为罕见等位基因［38］。对653个中国东部汉族家系中2 230条HLA-9位点单体型和两位点间连锁的数据库进行分析，提示HLA-DP位点由于与其他位点间较弱的连锁不平衡，改变了HLA-A-B-C-DRB1-DQB1 5位点单体型频率［39］。因存在种族和地区差异性，故建立中国人群HLA-9位点CWD数据库、单体型数据库，可作为中华骨髓库HLA-5位点 CWD数据库的补充，并有助于优化供体检索和筛选策略。

2. HLA-DPA1、DPB1等位基因错配及连锁错配对无关供者移植预后的影响：现有研究表明约80%非血缘HSCT中供受者存在HLA-DP位点错配［40］，目前在进行DP位点错配分析时，常采用国外的HistoCheck分析软件查询DPB1错配分值（dissimilarity score，DSS）［41］和T细胞表位（T cell epitope，TCE）模型，但这2种方法仅能分析HLA-DPB1等位基因的可允许与不可允许错配类型。

苏州大学附属第一医院基于建立HLA-9位点等位基因和单体型数据库，分析了单中心HLA-A、B、C、DRB1、DQB1、DQA1及DRB3/4/5（HLA-14/14）相合的250对非血缘allo-HSCT供受者的结果表明：仅有10.4%供受者DPA1、DPB1（HLA-18/18）相合，89.6%的供受者存在DPA1和（或）DPB1错配。与HLA-18/18相合组比较，当供受者DPA1相合，存在DPB1*02∶01/DPB1*03∶01等位基因错配时，移植后3年OS显著降低，NRM显著升高，考虑为不可允许错配；供受者存在DPB1*02∶02/DPB1*05∶01、DPB1*02∶01/DPB1*05∶01等位基因错配时，对移植预后无影响，考虑为可允许错配。该研究结果与DPB1 TCE模型判断结果均相符，且均为常见错配类型，为临床选择最优的错配供者提供了依据。

 （五）HLA-Loss和纯合子分析在allo-HSCT供者选择策略中的作用

肿瘤细胞表面HLA参与抗原的处理和呈递，对CD8+/CD4+T细胞识别肿瘤细胞及免疫调节是必不可少的。LOH是肿瘤细胞的一种染色体畸变，发生于HLA染色体区域的LOH即HLA-Loss［42］。由于肿瘤细胞表面发生HLA-Loss，肿瘤细胞逃避免疫系统的监视，引起白血病复发；并且缺乏T细胞介导的同种异体反应，患者输注原供者淋巴细胞不能获益，故在allo-HSCT后检测HLA-Loss可指导移植后复发患者的治疗。单体型allo-HSCT后发生HLA-Loss时，表现为患者与供者错配的HLA单体型全部或部分位点缺失。可应用基于荧光定量聚合酶链反应的KMR（针对非HLA多态性区域与最常见的HLA等位基因设计引物）、NGS方法进行HLA-Loss检测，两种技术各有优缺点：KMR方法灵敏度高，但只覆盖了HLA-A、-C、-DPB1位点的部分基因型，不能检测所有HLA位点的基因型；NGS覆盖率高，可以检测所有的HLA位点的基因型，但是灵敏度稍低，并且需制定实验室检测限，在结果判断标准等方面对实验室技术平台建设提出较高的要求。

1. 移植前HLA-Loss的结果分析：恶性血液病患者初诊时因白血病细胞负荷高，外周血中存在白血病细胞和正常细胞两种克隆状态。若HLA基因分型提示HLA-Ⅰ类/Ⅱ类位点或全部位点均为纯合子时，需考虑白血病细胞克隆发生HLA-Loss、HLA抗原表达下调［43］，此时应采集患者口腔黏膜细胞等非血液细胞进行HLA基因分型，避免发生HLA基因分型错误的情况。

2. 移植后HLA-Loss的结果分析：现有研究显示HLA错配移植后有25%~50%患者会发生HLA-Loss，上海交通大学附属第一人民医院、浙江大学附属第一医院的研究均发现：HLA-Loss在错配移植后急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）和急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患者中发生的比例接近［44］，移植后发生HLA-Loss的患者并不一定都会复发，但因HLA-Loss及相关原因复发的患者移植后生存较差，HLA-Loss检测可作为移植后预测患者复发的常规监测手段［45］。建议移植后患者定期进行骨髓的嵌合率检测，尤其对于高危患者，当提示供者比率下降时，建议进行HLA-Loss检测。苏州大学附属第一医院HLA配型实验室经验分享：在患者接受单体型相合移植后，当外周血检测结果提示为完全供者基因型，即供者移植物仍处于植入状态，唾液样本也可能检测到供者基因型或嵌合；当外周血检测结果提示HLA全部或部分位点分型为患者自体来源，且与供者错配单体型上的HLA基因型缺失或比例降低，同时唾液样本中供者基因型比例降低或无法检测到供者基因嵌入时，提示可能发生HLA-Loss。

3. HLA纯合子的结果分析：患者初次HLA基因分型中全部或部分位点等位基因型为纯合子，主要原因为遗传父母双方常见高频率HLA单体型。对于HLA位点等位基因全部或部分为纯合子的患者，在接受HLA全相合或单体型相合allo-HSCT后，由于缺乏供者T细胞介导的同种异体反应性，可能会造成GvL效应的降低［46］，从而增加疾病复发的风险。

 （六）二次移植供者的选择

对HSCT后疾病复发患者二次移植时可选择亲缘供者或无关供者［47］。在选择亲缘供者时可选择HLA全相合或单体型相合的供者，如果考虑疾病复发非供者因素造成，可选择与第一次移植相同的亲缘供者，但考虑到GVL效应，也可选择其他甚至存在不同HLA单体型相合的亲缘供者［48］。HLA-Loss型复发的患者在二次移植时，如存在患者和供者嵌合基因型，建议按患者原基因分型结果选择二次移植供者；如患者与第一次供者不同的1条单体型丢失，在二次移植时建议选择与第一次供者不同的单体型。在选择无关供者时，优先选择HLA基因相合度更高的供者，依次为HLA全相合、可允许等位基因/抗原错配的供者。

 （七）DSA对allo-HSCT供者选择及预后的影响

1. 移植前受者预存HLA抗体和DSA对供者选择及移植预后的影响：移植前受者进行HLA特异性抗体检测、供受者进行HLA-9位点基因分型，有助于判断移植前预存、移植后新生DSA和（或）非DSA（non-donor specific antibody，NDSA）。苏州大学附属第一医院研究结果表明：在非血缘供者HSCT中，移植后预存HLA抗体类型和MFI值的动态变化是影响Ⅱ~Ⅳ aGVHD和造血重建的主要因素［49］；联合上海儿童医学中心的研究显示，儿童AA患者接受HSCT后，预存抗体阳性受者较预存抗体阴性受者的TRM高，5年OS低，尤其是预存HLA-Ⅰ类抗体，5年OS更低［50］。国外研究认为在单体型相合移植中，移植前预存DSA MFI值>5 000是引起移植排斥的危险因素［51］。北京大学人民医院研究表明：在单体型相合移植中预存HLA抗体尤其是DSA，可以介导移植失败，导致造血重建延缓和移植物植入不良，影响患者预后；DSA MFI值≥10 000与原发植入失败显著相关［52, 53］。因此，预存高MFI值DSA抗体的受者，应在移植前后或清除抗体的治疗过程中动态检测HLA抗体，以监测预存、新生DSA和（或）NDSA及其MFI值的变化。对预存HLA抗体受者，首选HLA全相合的供者；当有多个潜在供者可选择时，根据供受者HLA基因分型，分析是否存在预存DSA，在相等条件下应选择无预存DSA的潜在供者。

2. 移植后新生HLA抗体和DSA对移植预后的影响：苏州大学附属第一医院研究结果表明：allo-HSCT后1个月新生的HLA抗体增加了移植后aGVHD的发生率，严重影响了受者的生存，且HLA-Ⅱ类抗体是主要的新生抗体类型；在移植后持续检测到新生DSA和（或）NDSA时，受者Ⅱ~Ⅳ aGVHD发生率显著升高，OS显著降低［54］。因此，对移植前抗体阴性的受者，移植后需重点关注新生抗体是否为DSA、NDSA或交叉反应组抗体。特别是移植后早期在免疫抑制剂使用期间即出现新生DSA，且在动态随访过程中DSA的MFI值不断升高或抗体类型增多时，应与临床保持沟通，加强随访，有利于临床及时采取干预治疗措施，降低移植后并发症的发生率。

 二、HLA与疾病相关性和药物超敏反应的临床应用

迄今已报道与HLA关联的疾病达500余种，主要是自身免疫性疾病，如强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）、银屑病、糖尿病、风湿性关节炎等。采用基因测序等技术进行HLA基因分型，可实现在DNA分子单核苷酸多态性水平研究HLA与疾病的相关性，发现与HLA等位基因型相关的疾病。

（一）HLA等位基因、单体型与疾病相关性的研究

1. 自身免疫性疾病：AS是一种慢性炎症性疾病。HLA-B27亚型与AS相关性研究表明，HLA-B27家族中包含的不同等位基因与AS的发病相关性不同。常见的等位基因B*27∶04、B*27∶05、B*27∶02、B*27∶07与AS呈现相关性，而有文献报道B*27∶06、B*27∶09与AS发病无相关性［55］。

银屑病是一种慢性、免疫介导的皮肤疾病，HLA-C*06∶02可以影响银屑病的遗传易感性、临床表现和治疗效果［56］。HLA-C*06∶02携带者的DNA甲基化与银屑病的发病密切相关，也与银屑病的药物治疗效果有关［57］。携带或不携带HLA-C*06∶02等位基因的银屑病患者，对乌司奴单抗（Ustekinumab）治疗反应具有差异性，携带HLA-C*06∶02患者在接受治疗6个月后治疗反应性优于不携带HLA-C*06∶02患者，单抗治疗应答率分别约为90%和65%［58］。

2. 血液系统疾病：苏州大学附属第一医院对AML、ALL、AA、骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）患者HLA-9位点等位基因、连锁单体型结果，与中华骨髓库CWD和已发表数据作为对照组的研究表明：在AML组A*11∶01等位基因频率较对照组显著升高，与A*11∶01连锁的A*11∶01-B*15∶02-C*08∶01-DRB1*12∶02-DQB1*03∶01单体型较对照组也显著升高，提示携带HLA-A*11∶01等位基因和单体型，与AML疾病发病机制及HSCT后复发风险增加等可能存在相关性［38, 39］。

另有研究表明HLA-A等位基因通过抑制NK细胞功能对AML患者移植后复发造成影响。HLA-Ⅰ类分子是NK细胞表面抑制性KIR受体的配体，其中已知Cw1、Cw3、Cw7、Cw8分子是KIR2DL2/L3的配体，其共同特点是HLA第80位氨基酸残基为天冬氨酸；Cw2、Cw4、Cw5、Cw6分子是KIR2DL1的配体，其共同特点是HLA第80位氨基酸残基为赖氨酸；具有Bw4表位的HLA分子是KIR3DL1的配体。体外实验表明，不同的HLA配体与抑制性KIR受体结合，表现出不同的教育和抑制NK细胞杀伤活性的能力。如：A*23、A*24和A*32基因均具有Bw4表位，其中A*24和A*32具有更强抑制NK细胞的能力。对1 729例接受了来自HLA-9/10或10/10等位基因相合非血缘allo-HSCT的AML患者进行回顾性分析表明，与没有Bw4表位的患者相比，A*24患者接受KIR 3DL1+供体移植后有更高的疾病复发风险［59］。

 （二）HLA等位基因与药物超敏反应及用药指导的临床应用

HLA等位基因与特定药物的超敏反应密切相关，国际药物遗传学工作机构，如美国临床药物遗传学实施联盟（Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium，CPIC）、荷兰药物遗传学工作组（the Dutch Pharmacogenetics Working Group，DPWG）、加拿大药物基因组学网络的药物安全（the Canadian Pharmacogenomics Network for Drug Safety，CPNDS）和药物监管机构，如美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA），建议对使用受HLA基因变异影响药物治疗的患者进行HLA基因分型，以优化药物使用的安全性，并推荐了药物使用的临床建议［60, 61］。卡马西平的严重药物反应与HLA-B*15∶02、B*15∶11、A*31∶01相关，携带这些等位基因的患者不建议使用卡马西平作为一线治疗药物，最好选择替代治疗方案。携带HLA-B*15∶02等位基因患者不推荐使用奥卡西平。阿巴卡韦引起的超敏反应与HLA-B*57∶01等位基因相关，携带HLA-B*57∶01等位基因患者不推荐使用阿巴卡韦。别嘌呤醇的药物反应与HLA-B*58∶01相关，有诱导斯蒂文斯-约翰逊综合征或中毒性表皮坏死松解症（Stevens-Johnson syndrome/toxic epidermal necrolysis，SJS/TEN）发生的风险，携带HLA-B*58∶01等位基因患者禁用别嘌呤醇。

 三、HLA基因分型在临床应用中的推荐意见

推荐意见25：对于拟进行初次、二次allo-HSCT的患者和潜在供者，推荐采用NGS或SBT技术，至少检测HLA-A、B、C、DRB1、DQB1位点；增加DPB1、DPA1、DQA1、DRB3/4/5位点，及非经典HLA位点和MIC基因的等位基因型别，可有助于分析和确定allo-HSCT供受者基因型相合程度及单体型是否相合。

推荐意见26：在潜在供者选择中，首选HLA-A、B、C、DRB1、DQB1、DPB1、DPA1、DQA1、DRB3/4/5及更多HLA位点相合的供者；其次选择HLA-A、B、C、DRB1、DQB1位点相合，其他位点有文献报道为可允许的等位基因错配或抗原错配供者。当存在HLA-A、B、C、DRB1、DQB1位点错配时，需进行供受者HLA可允许或不可允许错配分析，选择等位基因为可允许错配或抗原相合的供者。当有多个潜在供者存在相同HLA等位基因或抗原错配时，可结合年龄、性别、ABO血型、HLA抗体（包括DSA、NDSA）及KIR基因分型等结果综合考虑。

推荐意见27：在进行供受者HLA错配分析时，建议基于中国汉族人群HLA等位基因CWD、单体型频率和连锁数据库，分析等位基因和位点连锁错配类型，结合错配分值和TCE模型、中华骨髓库和国内外各移植中心的经验、患者疾病分类和疾病状态，从而全面系统地分析和判断HLA等位基因或抗原错配对于移植风险的影响。

推荐意见28：对于初诊患者HLA-Ⅰ类/Ⅱ类位点或者全部位点均为纯合子，建议送检口腔黏膜细胞等非血液细胞样本进行HLA基因分型复核；对于移植后复发患者建议同时送检移植后外周血和口腔黏膜细胞等非血液细胞样本进行HLA-Loss检测。

推荐意见29：对于移植前预存HLA抗体、移植后有造血重建不良等临床表现的患者，移植后新生DSA、NDSA或交叉反应组抗体的患者，建议定期动态检测特异性HLA抗体，随访HLA抗体类型和MFI值的变化，以降低移植后并发症发生的风险。

推荐意见30：推荐采用HLA等位基因、HLA单体型、HLA位点间连锁，进行与疾病或药物选择的相关性分析。不仅有助于临床进行疾病的诊断或鉴别诊断、药物的选择及避免药物不良反应的发生，还可进行HLA分子与疾病机制的相关性研究。

 四、展望

希望通过本共识未来能进行多中心临床和实验研究HLA等位基因、单体型、位点间连锁错配对allo-HSCT预后的影响，从而总结出中国人群HLA各位点的等位基因可允许或不可允许错配类型，才能使HLA分子在指导allo-HSCT选择潜在供者中发挥更重要的作用，及重视HLA在疾病相关性、药物不良反应、生殖遗传、输血不良反应、实体器官移植等领域中的临床价值［62, 63, 64］，不断拓展HLA在医学领域中的应用范围，才能在未来医学发展中发挥更大的作用。

共识编写委员会名单：

执笔者（按姓氏汉语拼音排序）：鲍晓晶（苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所）；陈璐瑶（苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所）；何军（苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所）；李杨（苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所）；袁晓妮（苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所）；张腾腾（苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所）

共识专家组委员（按姓氏汉语拼音排序）：安仕萍（天津市血液中心免疫血液学研究室）；鲍晓晶（苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所）；常英军（北京大学人民医院血液科）；陈静（上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心血液科）；陈璐瑶（苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所）；陈强（中国医学科学院输血研究所临床输血研究中心）；陈苏宁（苏州大学附属第一医院血液科）；邓志辉（深圳市血液中心输血医学研究所）；范俊杰（苏州大学附属儿童医院血液科）；方欣臣（中国科技大学附属第一医院检验科）；符粤文（河南省肿瘤医院血液科）；傅琤琤（苏州大学附属第一医院血液科）；高素君（吉林大学第一医院血液科）；何成涛（南京红十字血液中心研究室）；何军（苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所）；胡炯（上海交通大学医学院附属瑞金医院血液科）；胡绍燕（苏州大学附属儿童医院血液科）；黄河（浙江大学附属第一医院血液科）；霍明瑞（北京大学人民医院血液科）；江明（新疆医科大学第一附属医院血液病中心）；赖永榕（广西医科大学附属医院血液科）；李代红（天津市第一中心医院输血科）；李剑平（辽宁省血液中心输血医学研究所）；李捷（苏州大学附属儿童医院血液科）；李佩桐（吉林大学第一医院血液科）；李伟（北京市红十字血液中心HLA研究室）；李晓丰（辽宁省血液中心输血医学研究所）；李杨（苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所）；刘湘（北京博奥医学检验所HLA分型实验室）；刘颖（哈尔滨市血液中心输血研究所）；卢俊（苏州大学附属儿童医院血液科）；罗依（浙江大学附属第一医院血液骨髓移植科）；吕蓉（安徽省血液中心输血研究室）；马骁（苏州大学附属第一医院血液科）；毛伟（重庆市血液中心输血研究一所）；齐珺（陕西省血液中心HLA配型实验室）；仇惠英（苏州大学附属第一医院血液科）；沈捷（江苏省人民医院HLA实验检测中心）；宋献民（上海交通大学附属第一人民医院血液科）；宋永平（郑州大学第一附属医院血液科）；苏湘晖（岳阳市中心血站临床输血医学研究部）；孙竞（南方医科大学南方医院血液科）；孙自敏（中国科技大学附属第一医院血液内科）；谭湘芳（南华大学附属第二医院输血科）；唐晓文（苏州大学附属第一医院血液科）；万鼎铭（郑州大学第一附属医院造血干细胞移植中心）；王恒湘（空军特色医学中心血液科）；王建玲（陆道培血液病医院HLA分型实验室）；王珏（中国医学科学院输血研究所临床输血研究中心）；王荧（苏州大学附属第一医院血液科）；魏雪栋（苏州大学附属第一医泌尿外科）；吴德沛（苏州大学附属第一医院血液科）；吴小津（苏州大学附属第一医院血液科）；夏凌辉（华中科技大学附属协和医院血液科）；肖漓（解放军总医院第八医学中心呼吸学部研究所）；肖佩芳（苏州大学附属儿童医院血液科）；谢毓滨（长沙血液中心输血研究所）；徐筠娉（深圳市血液中心输血医学研究所）；徐雅靖（中南大学湘雅医院血液科）；徐杨（苏州大学附属第一医院血液科）；许兰平（北京大学人民医院血液科）；杨建民（上海长海医院血液病科）；杨晓琴（深圳华大医学检验实验室HLA分型实验室）；杨颖（上海市血液中心输血研究所）；姚艳华（苏州大学附属儿童医院血液科）；叶欣（广州血液中心输血研究所）；袁晓妮（苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所）；张德梅（山西省血液中心输血技术研究所）；张涛（重庆医科大学附属妇女儿童医院 重庆市妇幼保健院输血科）；张腾腾（苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所）；张弦（陆道培血液病医院血液科）；张学军（苏州大学附属独墅湖医院皮肤科）；朱传福（山东省血液中心HLA研究室）；朱小玉（中国科技大学附属第一医院血液科）

统稿：何军、鲍晓晶

终审：何军、吴德沛
参考文献
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